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醫用真空冷凍干燥機：血小板凍干再水化的條件及其凝血功能變化

      血小板(plaet)是由骨髓巨核細胞產生并釋放于血液循環中的zui小細胞,在止血和凝血過程中發揮著重要的作用。 由于血小板保質期較短，臨床輸注需求量大， 加之臨床輸注需求時間的不確定性， 造成了血小板過期浪費和臨床供不應求的兩難尷尬局面。 目前國內血小板主要保存方式是22℃振蕩保存，有效期為 5d。 此外血小板還可深低溫冰凍保存， 但這種方法的保存效果和臨床療效不確切。 冷凍干燥技術已廣泛應用于各種生物材料的保存， 凍干制品具有常溫下保存、 性能穩定、便于運輸的特點。 本研究以過期血小板為原料，探索血小板凍干再水化的條件，檢測其凍干再水化后凝血功能的變化， 為過期血小板再利用及新鮮血小板冰凍或低溫保存研究提供了依據。

1、 材料與方法

1.1 實驗材料

       1.1.1 血小板來源 實驗組選擇體檢合格， 一周內未服用阿司匹林等抗血小板**的自愿獻血者，用血細胞分離機單采富含血小板血漿，22℃振蕩保存 5d 過期；對照組選擇新鮮機采血小板。

       1.1.2 主要試劑和溶液 海藻糖 (CH22O11·2H2O，北京經科宏達生物技術有限公司)； 牛血清白蛋白(BSA，上海生工生物工程有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)； 血小板聚集誘導劑二磷酸腺苷(ADP，Sigma公司)；凝血酶(Sigma 公司)；膠原(Sigma 公司)；瑞斯托霉素(Sigma 公司)；CD62P-PE(Bioscience 公司)；PAC-1-FITC(BDIS 公司 )； 海藻糖加載緩沖液 ( 含50mmol/L 海藻糖，100mmol/L NaCl，10mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，pH 為 6.8)；凍干保護劑(含 20%海藻糖 ，1% 牛血清白蛋白 ，9.5mmol/L HEPES，142.5mmol/L NaCl，4.8mmol/L KCl，1mmol/L Mg-Cl2)；復水溶液為 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 比例混合制成。 以上試劑和溶液均在有效期內。

1.2 主要儀器 



醫用真空冷凍干燥機、恒溫振蕩水浴、流式細胞儀、血球計數儀、血小板聚集儀

1.3 實驗方法

        1.3.1 血小板的凍干保存 血小板濃縮液離心洗滌后重懸于海藻糖加載緩沖液中， 將上述懸浮液轉移進入離心管中，并用聚四氟乙稀生料帶密封，于37℃水浴中振蕩孵化 4h。 將孵化后的血小板懸浮液 800g 離心 3min。 去除上層孵化液，得到沉淀的血小板塊，加入凍干保護液打散重懸，使用血球計數儀進行計數， 調節血小板在凍干保護液中的濃度為 1×109個/ml。 將制備好的血小板凍干懸浮液裝入特制凍干血盒中，密封充注口。 將血小板凍干懸液先以 20℃/min 的速率凍結至-40℃， 預凍 2h后，再以 1.5℃/min 對擱板升溫至-30℃，退火 0.5h，然后進入一次干燥，-38℃維持一次干燥條件 20h，zui后以 0.2℃/min 的加熱速率使隔板溫度升高至20℃，維持二次干燥條件 10h 直至凍干結束。 凍干的血小板密封保存在室溫。

1.3.2 凍干血小板的水化 將 PBS 緩沖液和蒸餾水以 3:1 的比例混合制成血小板凍干復水液，將1ml 復水液在室溫下直接加入凍干樣品瓶中，輕輕震蕩直到樣品完全溶解于復水溶液中。

1.3.3 檢測血小板回收率 用血球計數儀分別對凍干前和凍干再水化后的血小板計數， 計算凍干再水化血小板回收率。凍干再水化血小板回收率(%)=凍干再水化后血小板計數/凍干前血小板計數×100%。

1.3.4 檢測血小板穩定性 凍干再水化血小板分別在室溫放置 0h、2h、4h、6h、8h 后，用血球計數儀測定血小板回收率。

1.3.5 血小板形態及超微結構觀察 用掃描電鏡觀察血小板的形態；分別以戊二醛固定、脫水、環氧樹脂包埋后制作超薄切片， 用透射電鏡觀察血小板超微結構變化。

1.3.6 血小板聚集反應檢測 將凍干血小板復水后轉入離心管中進行洗滌以去除細胞外保護劑，再用新鮮冰凍血漿重懸血小板， 調整血小板濃度為(0.2~0.3)×1012/L。 用 APACT-2 型血小板聚集儀檢測凍干再水化后血小板對四種同濃度誘導劑—凝血酶、膠原、ADP 和瑞斯托霉素的聚集反應。

1.3.7 血小板表面糖蛋白檢測 用三色流式細胞儀分別檢測凍干再水化血小板表面激活指標 CD62p和 PAC-1 的表達，經凝血酶激活后測定 CD62p 和PAC-1 的再表達。 再表達率=凝血酶處理后表達率-血小板表達率1.3.8 統計分析 數據以均數±標準差(x±s)表示，采用 SPSS16.0 統計軟件進行數據分析處理， 組間差異比較用 t 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2、 結果

2.1 血小板回收率及穩定性 實驗組和對照組間血小板計數有統計學意義(P<0.05)，凍干再水化血小板回收率為 49.36%
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